组织培养基本技术与基本知识

累积存活数则是由上向下加（即由高浓度向低浓度将存活数加起来），之所以可以如此加，是因为某一瓶细胞既然在低浓度病毒的感染下能产生病变，那么，在高浓度病毒感染时，一定也会产生病变，因此，当计算高浓度病毒造成病变瓶数时，也把它统计进去了。这就是为什么可以将死亡数进行这样的累加，同样某管细胞既然在高浓度病毒感染时不产生病变，那么这些瓶细胞在低浓度病毒的作用下也不应该产生病变。应用这种方法，其好处在于可以部分消除各个细胞管之间的差异。如果是用实验动物测毒价时，经过这样计算之后，可以部分消除不同个体之间的差异。

由上列累积表可以明显地看出，导致50%细胞病变的稀释度是在10-6（80%）和10-7

（20%）之间，根据此结果经过计算，可以相当精确地算出50%点（即能使半数细胞瓶发生病变的稀释量-TCID50终点），计算方法有数学法也有图表法。我们则选取一般采用的最简单的L.J.Reed氏或H.MuencH氏方法来计算出50％点。其公式为：

（立即高于50％的病变率）－50/（立即高于50%的病变率）--（立即低于50%的病变率）

那么将上述例子所得数据代入上式： 80-50/80-20=30/60=1/2=0.5

0.5即为50%细胞病变率是落在10-6和10-7之间的0、5处。 那么这个例子的TCD50=10-6.5 上述公式的原理如下：

已知10-6的病变率为80%，10-7的病变率为20%，那么，50%的病变率肯定介于80%与20%，亦即10-6和10-7两个滴度之间，即：

10-6 80% X

假设a 50% 1

10-7 20% 假设a处正好是50，那么可以列出等化四项式

假设在10-6和10-7这个区间的该病毒的致细胞病变率与接种量是成正比的，即接种病毒愈多则细胞病变的越多。

那么，设a正好是50% 10-6到10-7的距离为1

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10-6到a的距离为X 可得等化四项式，即

1：（80-20）=X：（80-50） X=80-50/80-20=0.5

X为10-6到a的距离，故0.5应加10-6上，所以50%细胞病变的稀释度（又称半数感染终点）应该是 10-6.5。也就是说该份待测病毒液稀释10-6.5 倍（10-6.5=1/106. 5）以后，每0.1毫升还能使半数细胞管感染，即含有一个“组培细胞半数感染量”（TCID50）。那么反过来讲，如果不稀释的原病毒液每0.1毫升就应当含106 .5个半数感染量（TCID50）了。这样该病毒的滴度（毒价）即为106.5TCID50/0.1毫升。按惯例病毒液滴度都要换算成每一毫升的含毒量，则上述毒液的滴度为107..5TCID50/1ml。由于我们可以知道TCID50的意义是什么？它是表示病毒数量的一种单位。我们不能直接数出病毒颗粒数目，因此就不能用“个”或“粒”作病毒计数单位，只能采用能使50%细胞培养管产生病变的病毒量作为病毒计数的基本单位。显然这种计数方法只反映了待测毒液中有感染力的病毒数。而不能反映其中无感染力的灭活病毒数。

＊ TCID50是简写符号： TC—组织培养（Tissue Culture） I—感染的（Infectious） D—剂量（Dose） 50—50%

它可以“翻译”为“使50%组织培养物感染的剂量”

注：为了方便起见，也可不用计算，可通过查表的方法得出TCID50，现把“按细胞病变管数计算TCID50的对照表”列于下面，以供参考使用。

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低50% 1/4 1/5 2/5 1/6 2/6 1/7 2/7 3/7 1/8 2/8 3/8 1/9 2/9 3/9 4/9 N/n 高50% % 25 20 40 17 33 14 29 43 12.5 25 37.5 11 22 33 44 0 3/4 75 50 45 71 43 60 41 54 78 40 50 66 39 47 60 80 33 3/5 60 29 25 50 23 37 22 32 60 21 29 43 20 26 37 63 17 4/5 80 55 50 57 47 63 45 60 81 44 55 71 43 52 63 83 37 4/6 67 40 36 63 34 50 32 44 71 31 40 57 30 38 50 74 25 5/6 83 57 52 77 50 66 48 61 83 47 57 73 45 54 66 84 40 4/7 57 22 19 41 17 29 16 25 50 16 22 35 15 20 29 54 12 5/7 72 47 43 70 40 56 38 52 75 37 47 63 36 44 56 79 30 6/7 86 59 54 78 52 68 50 63 84 49 59 75 48 56 68 86 42 5/8 62.5 32 29 55 27 43 25 36 65 24 32 48 24 30 43 67 19 6/8 75 50 45 71 43 60 41 54 78 40 50 66 39 47 60 80 33 7/8 87.5 60 55 79 53 69 50 64 82 49 60 74 49 57 69 86 43 5/9 55 17 14 33 13 23 12 19 42 11 17 28 11 15 23 45 9 6/9 67 46 36 63 34 50 32 44 71 31 40 57 30 38 50 74 25 7/9 78 53 48 74 46 62 44 57 80 42 53 70 42 50 62 82 36 8/9 89 61 57 80 53 70 52 65 85 51 61 75 50 58 70 87 44 N/n 100 67 62 83 60 75 58 70 88 57 67 80 56 64 75 89 50 ﹡ N代表任何数据 按细胞病变管数计算TCID50的对照表

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第三章 基本知识

第一节 影响离体细胞生长繁殖的一些因素

细胞生长和繁殖的最好条件自然是在其原来所在的机体内，一旦将机体的细胞移到体外来培养，那么就有一些问题要加以解决，在体外必须模拟体内的环境，以使细胞能在体外生存、生长和繁殖，因此对细胞在体外的生存条件和所需营养问题必须加以讨论。在这里我们只能谈到一些最基本的条件和营养问题。至于一些细胞的复杂的代谢机制此处不予介绍。

一、温度：多数哺乳动物体温在37℃-38.5℃，禽类体温略高，可达39-40℃左右。因而对哺乳动物的离体细胞而言，最适温度在37℃至38.5℃。同样对禽类的离体细胞最适温度为39℃左右。在较低的温度下对细胞的影响还不太大，如25℃也能很好地生长，只是比在37℃略慢些，而在4℃冰箱中维持一段时间对细胞也无明显的损害，因此，当细胞单层已长好，尚不需使用，需等一段时间，那就可以将这些细胞放在较低的温度（如25-30℃），甚至4℃冰箱中。可是细胞对较高的温度却比较敏感，例如对很多哺乳动物细胞，一旦温度升到41-42℃时，则细胞在12-24小时内死亡脱落，如温度升到45℃，细胞在一小时内被杀死。各类细胞对温度的要求也不一样，对多数哺乳动物的细胞来说以上情况是适用的，但对某些细胞来说，虽然是哺乳动物的细胞，却以较低的温度合适。例如人的皮肤上皮细胞，通常认为最好生长在较低的温度中。而对于一些冷血动物，如鱼类的细胞就不能在超过20℃的温度下生长，两栖类如蛙的组织，细胞也以在低温中生活为好。可见对某种动物的某种组织，其生活的最适温度要看其机体生活的最适温度来决定。

上面谈到细胞能耐受4℃保存一段时间而不表现有明显的损害，仅使细胞分裂延缓而已，但如果将细胞冷至冰点或以下，则会引起细胞以外的水结冰，致使细胞周围的溶液浓缩，接着水从细胞中弥散至周围液体中，结果使细胞内的溶液也高度浓缩，这种高浓度的溶液就可以引起细胞死亡。但是，如果在培养基（营养液）内加入保护剂，例如甘油（一般加15%），或二甲基亚砜（DMSO），然后使细胞逐渐冷冻（经0.63℃/分钟的速度下降，经40-60分钟）至非常低温（-70℃），则可能保存数月至几年之久，此时细胞的代谢完全停止了，一旦迅速融化（2-3分钟）之后仍可培养复活。一般传代细胞就采用这种方法加以保存。

以上谈到细胞对41-42℃以上的较高温度是不能忍受的，会被热死。在组织培养过程中，往往由于保温箱或温室的恒温控制器的失灵，而使温度上升，而使细胞热死。热死的原因可有以下几点：

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