大肠杆菌高细胞密度发酵

3.方案实施

3.1 种子的扩大培养

种子培养基经过配制和灭菌之后，在超净工作台中，用接种环从保存斜面中接一环至装液量为60ML的1000ML摇瓶中， 250r/min,37℃ ，摇瓶培养12~16h，制作两瓶种子液。

3.2 发酵罐的前期准备

3.2.1发酵罐的清洗

发酵罐的清洗 发酵罐使用前后都应认真清洗，特别是前后两次培养采用不同的菌株时，更应注意清洗和杀菌工作。发酵罐内可进行清洗的任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂菌的滋生地。易被忽略而未能充分清洗的地方有喷嘴内部与取样管内以及罐顶等处。

3.2.2发酵罐溶氧电极和PH电极的校正 用标准溶液校正电极

3.3发酵罐的灭菌——实消

配制发酵培养基并加入发酵罐进行灭菌

①排气管为硅胶管,一端装有过滤装置，以保证蒸汽能自由出入发酵罐，同时不会出现染菌现象．

②取样口上连接一段硅胶管，在硅胶管上安装节流夹，以防止培养基在灭菌时流出。 ③装入发酵罐容积60％的培养基后，通入高压蒸汽加热发酵罐,在121℃下灭菌20min。当灭菌完成后，确认排气口正常后，以0.3~5L/min的通气量通入过滤气体．接通冷却水管脚开挽拌在低转速下进行培养基的冷却．

3.4 接种

接种是在发酵罐顶部接种口进行。适当降低通风量，在接种口四周缠绕上经酒精浸泡的脱脂棉，点燃后戴上石棉手套,迅速打开接种口，将菌种加入到发酵罐中，接种量为1％，然后将接种口盖子在火焰中灭菌后盖好。在37℃，pH7.4下进行 ，搅拌速度为300rpm。通气量100L/h.的条件下进行发酵培养。

3.5 取样检测分析

3.5.1还原糖含量的测定

还原糖含量测定用的是菲林试剂法。

5

3.5.2氨基氮含量的测定

氨基氮含量的测定用的是甲醛滴定法 3.5.3菌体浓度的测量

用分光光度仪在OD600下测定菌液的吸光度.对于高于1.0的菌液要进行稀释，并进行吸光度的测定。此时菌体密度即为吸收值与稀释倍数的乘积。

自培养操作开始起，每4h取一次样。取样时将取样管口流出的最初15mL左右培养液作为废液，取随后流出的培养液10mL。 3.5.4实验是原始数据

3.6 补料

根据样品中还原糖的含量、氨基氮的含量、PH、溶氧量（DO值）、菌体密度（OD值）的变化，进行补料培养基的配制灭菌后，用补料瓶进行补料，期间要注意无菌操作和要注意蠕动泵运转中自于硅胶管的弯曲折叠，出现的阻塞现象以及水的渗漏等问题。特别需要注意在一定的阶段泡沫有可能大量生成。

3.7 倒罐

为了安全起见，防止菌体污染环境，倒灌前须对发酵液进行灭菌，升温到90度，灭菌三十分钟，倒掉发酵液，并把发酵罐彻底的进行清洗干净。

6

4.收获与致谢

本课题设计在进行过程中得到李安华老师的悉心指导，论文行文你过程中李老师多次帮我分析思路，开拓视角，在我遇到困难想要放弃的时候给予我最大的支持和鼓励。李老师严谨求学的治学态度，踏实坚韧的治学精神，两是我终生受益。在此，向李老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。

感谢这两周来生物与食品工程学院所有老师对我学习上的帮助，正是你们的辛勤工作，才使我得以顺利地完成这次课程设计。

感谢我们课题组所有成员，在我实验过程中给予我技术上的帮助，心理上的支持与鼓励。没有大家的相互配合，相互帮助，也就没有我们最后的成功，我们共同思考解决了所遇到的难题，为我以后在求学和生活道路上打好了坚实的基础。

最后再一次诚挚的感谢所有在课题设计中帮助过我的良师益友和亲爱的同学们。

7

5.参考文献

[1] 李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288. [2] 陈坚 ,李寅 ,毛英鹰 ,等. 生物工程学报 ,1998 ,14(4) :452～455. [3] 李民 ,陈常庆 ,朴勤 ,等. 生物工程学报 ,1998 ,14(3) :270～275. [4] 杨汝燕 ,李民 ,陈常庆. 工业微生物 ,1998 ,28(3) :30～33. [5 ] 李民 ,陈常庆 ,朴勤等 ,生物工程学报 ,1998 ,14 (3) :270~275. [6] 杨汝燕 ,李民 ,陈常庆 ,工业微生物 ,1999 ,29(1) :25～28. [7] 徐皓 ,李民 ,阮长庚 ,等. 工业微生物 ,1998 ,28(2) :20～25.

[8] 刘社际 ,葛永红 ,杨立明. 中国生物制品学杂志 ,1999 ,12 (1) :29 ～31.

8

6. 附件

指导教师评语： 课程设计报告成绩： ，占总成绩比例： 课程设计其它环节成绩： 环节名称： ，成绩： ，占总成绩比例： 环节名称： ，成绩： ，占总成绩比例： 环节名称： ，成绩： ，占总成绩比例： 总 成 绩： 指导教师签字： 年 月 日 本次课程设计负责人意见： 负责人签字： 年 月 日

9